SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO – NHỮNG MẸO VẶT HỮU ÍCH (PHẦN 7).

Peak nở rộng.

Trong quá trình phân tích HPLC, ít nhiều chúng ta đã gặp trường hợp peak của chúng ta bị nở rộng ra hai bên. Điều này nếu không được khắc phục hiệu quả sẽ làm cho chúng ta mất rất nhiều thời gian và công sức. Vậy thì chúng ta hãy cùng nhau tìm hiểu nguyên nhân gây ra hiện tượng này là gì và phòng tránh,khắc phục như thế nào.

Dưới đây là hình ảnh của 1 phổ đồ có peak nở rộng:

 

Peak có thể nở rộng tất cả các peak như hình trên hoặc đôi khi chỉ là 1 vài peak ngẫu nhiên mà thôi. Nguyên nhân chính của hiện tượng này là do: cột của chúng ta đã có tuổi và bị mất hiệu năng, cột bị tắc nghẽn, các mối nối trong hệ thống không tốt, thể tích tiêm mẫu hoặc nồng độ mẫu quá lớn. Ngoài ra khi tiến hành phân tích các mẫu có phân tử khối quá lớn (protein hoặc polymer) cũng gây nên hiện tượng nở rộng peak.

Vậy thì chúng ta khắc phục như thế nào. Nhìn chung chúng ta sẽ có 2 vấn đề chính đó là do phần cứng (cột sắc ký, các mối nối,…) và do phương pháp phân tích.

Với vấn đề do cột sắc ký thì câu trả lời vẫn như các phần trước đó là tiến hành vệ sinh cột. Để phòng tránh hiện tượng này xảy ra, chúng ta luôn lựa chọn cột tốt, bảo quản cột cẩn thận ( luôn vệ sinh cột định kỳ, bảo quản đúng cách và dùng các biện pháp bảo vệ cột khỏi nhiểm bẩn).

Với vấn đề về phương pháp phân tích thì chúng ta có thể khắc phục như sau. Nếu phương pháp của chúng ta có thể tích tiêm mẫu quá cao, chúng ta có thể chỉnh lại thông số này để khác phục hiện tượng trên, cũng như mang đến kết quả phân tích tối ưu nhất.

 

Hình: Với thể tích tiêm quá cao sẽ gây ra hiện tượng peak nở rộng.

Còn khi tiến hành phân tích các mẫu có phân tử khối quá lớn như các polymer, protein chúng ta cần xây dựng các phương pháp thích hợp với trang bị phần cứng chuyên dụng. Ví dụ sử dụng các loại cột phân tích chuyên dụng với bộ ổn cột và đầu dò chuyên dụng để mang lại kết quả tốt nhất. Ngoài ra, khi tiến hành phân tích các dạng protein, acid amine chúng ta có thể tiến hành sử dụng các thiết bị chuyên phân tích các chất này. Như của hãng Hitachi chúng ta có hệ thống AAA L-8900.

 

Nguyễn Hoàng Dũng – Product Manager of Hitachi-hightechnology, 2H Instrument Co.ltd Viet Nam

Tel: 0973424508 – email: dunghitman@gmail.com

Address: Toà nhà HHM, số 157-159 Xuân Hồng, Phường 12, Quận Tân Bình, Tp. Hồ Chí Minh.

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO – NHỮNG MẸO VẶT HỮU ÍCH (PHẦN 6- tiếp theo)

Peak kéo đuôi – tiếp theo.

Như đã trình bày ở phần hôm qua, chúng ta biết được rằng vấn đề peak kéo đuôi trong HPLC có thể do nhóm silanol có trong cột gây ra. Vậy để khắc phục vấn đề này như thế nào, chúng ta hãy cùng nhau xem tiếp bài hôm nay về phương pháp hạn chế lực liên kết thứ cấp này.

Chúng ta hãy cùng nhau tìm hiểu thế nào là nhóm Silanol và nó ảnh hưởng thế nào mà gây ra hiện tượng peak kéo đuôi.

Thông thường cột sắc ký pha đảo được cấu tạo từ các hạt silica  như hình sau:

Chính các hạt silica này là tác nhân giúp cho sự phân tách diễn ra trên cột – 3. Tuy nhiên trong quá trình sản xuất sẽ vô tình sinh ra các nhóm -OH trên dây carbon của các hạt này. Chính các nhóm này đã làm cho mẫu của chúng ta khi chạy sẽ bị kéo đuôi, giảm độ chọn lọc, độ tin cậy. Có 3 dạng nhóm -OH trên các dây của hạt silica:

Trong 3 dạng silanol này thì dạng Geminal Silanol sẽ có liên kết mạnh nhất và sẽ làm cho peak của chúng ta bị chẻ nhiều hơn. Theo 1 bài báo phân tích – 1, người ta đã tiến hành chạy thử pyridine với các cột sắc ký có 3 dạng silanol trên và ta thu được phổ đồ sau.

Chú thích: A-Isolate Silanol; B-Vicinal Silanol; C-Geminal Silanol.

Vì vậy tùy loại Silanol mà có gây ra hiện tượng peak kéo đuôi hay không. Với các công nghệ chế tạo cột hiện nay, các hãng chế tạo cột danh tiếng đã gần như loại bỏ được khá nhiều các dạng silanol này nhằm mang lại kết quả tốt nhất.

Như chúng ta cũng biết hiện tượng kéo đuôi này do hiện tượng dư thừa nhóm Silanol trong cột gây ra. Vì vậy để giải quyết triệt để vấn đề này có lẽ việc lựa chọn cột có chất lượng phù hợp là quan trọng nhất. Khi lựa chọn cột, chúng ta nên chọn cột sắc ký từ những nhà cung cấp danh tiếng như Restek, Tosho,… để có được kết quả tối ưu nhất.

Ngoài ra bằng phương pháp hóa học chúng ta cũng có thể giảm thiểu phần nào hiện tượng peak kéo đuôi. Chúng ta hãy cùng xem xét thí nghiệm sau đây – 2 : khi phân tích các amine:1 Phenylpropanolamine; 2 Epherine; 3 Amphetamine; 4 Methamphetamine; 5 Phentaramine.

Sử dụng cột Alkyl-C8; 4,6x150mm; 5mL. Pha động: 15% ACN – 85% Na₂HPO₄ 25mM pH 7.0; Tốc độ dòng: 1.0mL/phút.

Thu được phổ đồ như sau:

Rõ ràng chúng ta thấy có sự kéo đuôi đã diễn ra trong phổ đồ trên hình. Vậy thì khi các nhà nghiên cứu thay đổi pH của pha động thì chúng ta thu được kết quả sau đây:

Khi giảm pH của pha động xuống thì hiện tượng kéo đuôi đã được khắc phục thấy rõ. Tuy nhiên, kết quả thí nghiệm trên cũng cho thấy rằng thời gian lưu sẽ giảm khi giảm pH của pha động xuống tuy nhiên không nhiều lắm.

Trong 1 số nghiên cứu khác chúng ta cũng thu được kết quả tương tự với việc tăng pH của pha động lên. Nhưng cùng với việc tăng pH lên, thời gian lưu của mẫu cũng tăng lên theo và điều nay làm tăng thời gian phân tích mỗi mẫu lên khá nhiều.

Vì vậy, theo tôi để khắc phục triệt để hiện tượng peak kéo đuôi do lực liên kết với nhóm silanol sinh ra chỉ có thể khắc phục triệt để bằng các loại cột chất lượng cao mà thôi. Các biện pháp khác chỉ là tạm thời.

Tài liệu tham khảo:

1 – Study of Secondary Interaction Based on Residual Silanol Groups for Reversed-Phase Liquid Chromatography II – Norikazu Nagae Ph.D, Kouji Yamamoto, Chiaki Kadota ChromaNik Technologies Inc.

2 – Agilent – online.

3 – www.restek.com/seminars.

 

Nguyễn Hoàng Dũng – Product Manager of Hitachi-hightechnology, 2H Instrument Co.ltd Viet Nam

Tel: 0973424508 – email: dunghitman@gmail.com

Address: Toà nhà HHM, số 157-159 Xuân Hồng, Phường 12, Quận Tân Bình, Tp. Hồ Chí Minh.

 

Sắc ký lỏng hiệu năng cao – Những mẹo vặt hữu ích (Phần 2).

Áp suất.

 

Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao thì áp suất có ảnh hưởng rất nhiều đến giá trị phân tích. Bên cạnh đó nếu xét về mặt kỹ thuật thiết bị thì áp suất ảnh hưởng lớn đến tuổi thọ của thiết bị. Vì vậy khi gặp các rắc rối về áp suất thì chúng ta cần phải giải quyết nó 1 cách toàn diện.

Khi nói đến vấn đề áp suất thì chúng ta sẽ gặp các hiện tượng sau:

1. Áp suất quá cao so với bình thường: đây là vấn đề thường gặp nhất ở các phòng kiểm nghiệm. Với hiện tượng này sẽ làm cho tuổi thọ của thiết bị chúng ta bị giảm ( các đường ống, van đóng mở, flow-cell,…), cột bị giảm tuổi thọ,… Ngày nay các hệ thống HPLC đều có hệ thống an toàn của riêng nó vì vậy khi gặp việc áp quá cao thiết bị sẽ tự ngắt đảm bảo an toàn thiết bị. Nhưng như vậy sẽ làm giảm hiệu suất làm việc của phong kiểm nghiệm. Thử nghĩ, chúng ta lên mẫu xong, định sẽ chạy qua đêm nhưng vì áp suất tăng đột ngột làm hệ thống bị ngừng. Thế là sáng hôm sau mình phải chạy lại từ đầu.
2. Áp suất thấp hơn so với bình thường: đây cũng là 1 vấn đề thường gặp ở các phòng kiểm nghiệm (dù ít khi gặp hơn). Vấn đề này có 2 nguyên nhân chính: thứ nhất là do lỗi của kiểm nghiệm viên – thiết lập bơm không đúng như quy trình; thứ hai là do hệ thống bị rò rỉ ở đâu đó. Ở nguyên nhân do kiểm nghiệm viên, chúng ta hãy kiểm tra lại quy trình và thiết lập của máy. Ở nguyên nhân thứ hai, mọi thứ sẽ khó hơn. Chúng ta phải kiểm tra trên phần mềm của máy xem có báo rò rỉ ở đâu module nào không – ở các dòng máy của Hitachi đều có trang bị tính năng này. Sau đó kiểm tra đường ống ở từng module, bắt đầu từ bơm, lên đến autosampler, column oven. Đôi lúc chúng ta phải nhờ đến hỗ trợ kỹ thuật bên nhà cung cấp – với dòng Chromaster và sản phẩm cung cấp bởi công ty 2H thì các bạn sẽ được hỗ trợ trong vòng 24 giờ từ lúc có sự cố – để tìm hiểu chổ rò rỉ ở đâu.

Nhận biết nguyên nhân gây ra áp suất cao và phương hướng giải quyết:

Kiểm tra áp suất của hệ thống khi có cột và khi không có cột trong hệ thống. Chúng ta thử gỡ cột ra và thay thế bằng ống mao quản và theo dõi áp suất của hệ thống. Điều này giúp ta phát hiển ra hệ thống đang bị nghẹt do hệ thống bên trong hay là do cột.

• Nếu sau khi gỡ cột ra mà áp suất hệ thống vẫn cao. Có thể là hệ thống đường ống đã bị nghẹt. Chúng ta cần liên lạc với bảo trì của hãng để có thể đưa ra cách vệ sinh tốt nhất cho máy. Lưu ý rằng khi bên bảo trì của hãng xuống sữa chửa, chúng ta cần nhờ họ hướng dẫn chúng ta biết cách để sau này có thể giải quyết vấn đề tương tự.
• Nếu gỡ cột ra mà áp suất hệ thống giảm xuống. Điều này chứng tỏ cột của chúng ta đang gặp vấn đề.

Nguyễn Hoàng Dũng – Sale and application 2H Instrument Co.ltd Viet Nam

Tel: 0973424508 – email: dunghitman@gmail.com

Address: Toà nhà HHM, số 157-159 Xuân Hồng, Phường 12, Quận Tân Bình, Tp. Hồ Chí Minh.